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显微镜看见病毒的百年历程
[ 编辑:admin | 时间:2020-11-11 17:23:44 | 浏览:69次 | 来源: | 作者: ]

  20世纪30年代,电子显微镜的创造使神秘的病毒总算现出了真身,仅仅电子显微镜的原理决定了它无法用于活细胞的调查及获取生物活动的动态信息,而攻克致病病毒,需要深化了解病毒在活细胞内感染、复制及开释的动态进程。
  科学界期待着能有可获取生物进程动态信息的、更高分辩率的光学显微镜。
  光学显微镜的“阿贝极限”终究有没有或许被打破呢?
  尽管每项科学技能的打开都会历尽艰辛,仅仅没想到,真实打破“阿贝极限”竟用了百余年,在此期间数项新技能的创造起到了极为关键的作用!
  相 衬
  “相衬”是显微技能中的一个严重前进。
  光学显微镜调查细胞时一般都需要染色,这是因为细胞结构中大部分组分都是通明的。通明度高的物体也称为位相物体,光波经过位相物体时不改动振幅 (光的强弱) 只改动位相,但人眼只能辨别出振幅的改变,因而在光学显微镜下难以区别不同的细胞组分。
  用有机染料对不同的细胞组分进行选择性染色后,可借助不同的色彩反衬来进步细胞不同组分图画的比照度,便于更清楚地进行调查和研讨。但染色是一个非常困难和耗时的进程,常常会对调查的生物样本发生伤害,乃至杀死细胞。
  波的位相示意图
  有没有办法让光学显微镜的生物样本可以不经染色而直接清楚地调查到活细胞的内部结构呢?
  20世纪30年代初,荷兰的弗里茨·泽尼克 (Frits Zernike) 在试验中偶然发现:不行见的光相位改变可以转变为可见的振幅改变,他依据位相理论研讨出了位相反衬法 (一种光学信息处理办法) ,经过某种空间滤波器将位相改变发生的不行见信息转化为与之等价的可见的振幅信息,改善通明物体成像的反衬度,可大大进步通明物体的可分辩性。
  弗里茨·泽尼克(Frits Zernike)
  泽尼克使用光的干与原理,在传统的光学显微镜中加入相位板 (将位相差转换成振幅差) 研宣布相衬显微镜 (Phase Contrast Microscope,简称PCM) 的原型机并申请了专利,惋惜其时他的创造没有受到重视。
  第二次世界大战的爆发影响了泽尼克的研讨,但他以百折不挠的精力不断改善技能。1941年,第一台有用的相衬显微镜总算在蔡司公司诞生。其时的显微镜调查细胞时都需要染色(染色会杀死细胞) ,而相衬显微镜则可直接调查到活细胞的内部结构。
  现在,大部分高级光学显微镜及电子显微镜中都配置了相衬部件。相衬显微镜在细菌学、病理学等方面使用广泛,生物学研讨因而有了极大打破(泽尼克因证明相衬法及创造相衬显微镜的奉献获1953年诺贝尔物理学奖)。
  早期的相衬显微镜
  下排是通明样品加上相衬技能后的显微图画
  荧 光
  荧光的发现为后来超分辩率光学显微镜的研发打下了基础。
  早在1845年,英国皇家学会的约翰·赫歇尔 (John Herschel) 在一份报告中描述了他调查到的一种现象:加了硫酸奎宁 (一种药物) 的苏打水在太阳光照射下会宣布天蓝色的光。今后,虽然也有人发现相似的现象,但一向没人能给出科学的解释。
  约翰·赫歇尔(John Herschel)
  1852年,英国的乔治·斯托克斯 (George Stokes) 在他的巨著《论光的折射率改变 (On the Change of Refrangibility of Light) 》中指出:用分光计调查太阳光照射奎宁和叶绿素的水溶液时,只有当溶液置于光谱的紫外光区域才会发生所发光的波长比入射光波长要长效果。
  斯托克斯断定:这种现象是由于这些物质吸收光能后重新发射出不同波长的光 (属光致发光),并非因光的漫射作用引起,他把这种光称为荧光 (Fluorescence)。
  1864年他在一次演讲中初次提出:荧光可作为一种剖析东西,惋惜他的建议没能被很快地使用于光学显微成像技能。
  乔治·斯托克斯(George Stokes)
  过了40多年,德国的奥古斯特·科勒 (August Khler) 与亨利·西登托普夫 (Henry Siedentopf) 于1911年研宣布首个荧光显微镜 (Fluorescence Microscope) 测验设备。
  其时的荧光显微镜以紫外光线为光源,用荧光色素对观测方针 (细菌、植物、动物安排等)进行染色处理,紫外光的照射会激起观测方针上的荧光物质宣布荧光,研讨者依据自发荧光的成像打开研讨。
  荧光显微镜可用于调查细菌、植物和动物安排中的自发荧光现象。但因植物和动物安排中的自发荧光很弱,加之其时相关的技能还不行成熟,荧光显微镜的使用在20世纪初期打开较慢。
  奥古斯特·科勒(August Khler)、亨利·西登托普夫(Henry Siedentopf)
  第一台荧光显微镜测验设备
  20世纪30年代后,得益于各相关科学范畴技能的前进和立异,荧光显微成像技能迎来了新的打开机会。
  1935年,奥地利的马克斯·海廷格 (Max Haitinger) 等人改善了生物安排标本的染色技能,用荧光色素染色来符号不能自发荧光的特定安排成分、细菌和其它病原体,标本的荧光亮度增强了,在荧光显微镜下可调查到生物安排的续发性荧光。20世纪50年代,跟着荧光抗体符号办法及荧光显微镜设备的改善,荧光技能的使用逐渐推行。
  日本的下村修 (Osamu Shimomura) 等人1962年从维多利亚水母中发现了一种奇特的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其受激起而宣布绿色荧光。1974年,他们得到了这种蛋白的纯化物,称为绿色荧光蛋白 (Green Fluorescent Protein,简称GFP) 。绿色荧光蛋白的最突出特色是光毒性比传统的荧光分子弱得多,非常适合用于对活细胞进行符号。而依据绿色荧光蛋白的光学成像技能可使调查者直接看到从微观到微观各个层次的生命现象。
  下村修(Osamu Shimomura)
  在发现绿色荧光蛋白20多年后,美国的马丁·查尔菲 (Martin Chalfie) 于1993年经过基因重组技能使除水母以外的生物 (大肠杆菌等) 也发生出绿色荧光蛋白。他将绿色荧光蛋白真实使用于生物样品的符号,树立起用绿色荧光蛋白研讨基因表达的根本办法。由于许多严重疾病都与基因表达异常相关,查尔菲的成果含义严重。
  美籍华人钱永健 (Roger Y. Tsien) 大幅度改造优化了绿色荧光蛋白,提升了它的发光功率,还进一步打开出红、蓝、黄色的荧光蛋白,在生物学研讨范畴得到了广泛使用。这些荧光蛋白成为生物学家们得心应手的东西,实时监测各类病毒“作案”进程的愿望已可以完成了。
  下村修、查尔菲与钱永健三位科学家因发现、提取和改善绿色荧光蛋白的杰出奉献获得了2008年诺贝尔化学奖。
  马丁·查尔菲(Martin Chalfie)
  钱永健(Roger Y. Tsien)
  荧光显微镜
  荧光符号的重组病毒感染模型体系
  激 光
  “强光源”也是迫切需要处理的关键技能!
  阿尔伯特·爱因斯坦 (Albert Einstein) 1916年提出了“关于辐射的量子理论 (On the Quantum Theory of Radiation) ”,其间包含“受激辐射的光放大 (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation,简称Laser) ”的概念 (中文译为激光),这是怎么得到强光源的一个思路,他的论说为后来激光的完成奠定了理论基础。
  但在自然界一般光源中,发生受激辐射的成分很少,其时的人们并没认识到该理论的实践使用价值。
  阿尔伯特·爱因斯坦(Albert Einstein)(左),他1916年宣布的论文(右)
  依据爱因斯坦的理论,几十年之后的1953年,美国的查尔斯·唐尼斯 (Charles Townes) 研发成功一台受激辐射微波放大设备。后来该项技能由微波扩展到红外及可见光范围。
  1958年,唐尼斯与亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)在《物理评论(Physical Review)》杂志上宣布论文,论述了研发激光器的或许性以及所需的条件,指出这种激光具有亮度极高、单色性好、方向性好的特色。
  就在同一时期,苏联的亚历山大·普罗霍洛夫 (Aleksandr Prokhorov) 及尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov) 也提出了相似的想象。他们的想象非常吸引人,许多国家竟相开始研发激光器,各种试验方案都有,仅仅都未获得成功。
  这几位都是了不得的人物,赫赫有名的科学大伽,爱因斯坦就不必说了。而唐尼斯、普罗霍洛夫及巴索夫三人共享了1964年诺贝尔物理学奖,肖洛则获得了1981年诺贝尔物理学奖。
  亚瑟·肖洛(Arthur Schawlow)、查尔斯·唐尼斯(Charles Townes)
  亚历山大·普罗霍洛夫(Aleksandr Prokhorov)、尼古拉·巴索夫(Nicolay Basov)
  真实研宣布第一台激光器的是美国加利福尼亚州休斯航空公司试验室的西奥多·梅曼(Theodore Maiman)。1960年5月16日,梅曼在自己研发的红宝石激光器上成功获得了波长为694.3纳米的激光。7月7日,休斯公司正式宣布了这个音讯。此后,不同作业物质的激光器连续研宣布来,如氦氖气体激光器、二氧化碳激光器等,激光在各范畴的使用研讨也敏捷打开。
  激光的亮度可比一般光源高20个量级,并且是在包含红外可见光紫外直至X射线波段内的相干辐射光源,含义极为严重,因而被誉为是20世纪继原子能、计算机、半导体之后的又一严重创造。梅曼获得富兰克林学会、美国物理学会、光学学会等多个奖项,曾两度被诺贝尔奖提名,惋惜未能获得诺贝尔奖。
  西奥多·梅曼(Theodore Maiman)与他研发的红宝石激光器
  共聚集
  激光技能的打破使另一关键技能——“共聚集成像”的想象有了成功的或许。
  共聚集成像 (Confocal Imaging) ”的想象是美国的马文·明斯基 (Marvin Minsky)(被称为“人工智能之父”) 在20世纪50年代提出的。
  其原理是使用逐点扫描照明,并用空间针孔滤波手段去除样品焦点平面外散射光进行共聚集成像。他为此想象申请了专利,也研宣布一台共聚集扫描显微镜的样机。
  但其时缺少适用的超强光源,加之数据处理才能也还达不到所需的标准,这个想象实践上只停留在理论阶段。
  马文·明斯基(Marvin Minsky)
  明斯基研发的共聚集扫描显微镜样机
  梅曼的激光器研发获得成功之后,美国的保罗·达维多维茨 (Paul Davidovits) 和大卫·埃格尔 (David Egger) 于1969年以氦氖激光器为激起光源,制成了一台激光扫描显微镜原型机。
  1978年,德国的托马斯·克里默 (Thomas Cremer) 和克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)兄弟初次提出了共聚集激光扫描显微镜 (Confocal Laser Scanning Microscope,简称CLSM) 的设计方案:在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描设备,用激光聚集逐点扫描办法结合荧光符号生物样品的三维勘探办法,经过计算机处理手段重构生成三维图画(与扫描电子显微镜相似)。
  真实商业化的共聚集激光扫描显微镜于1987年问世。
  克里斯托夫·克里默(Christoph Cremer)、托马斯·克里默(Thomas Cremer)
  共聚集激光扫描显微镜
  从理论上说,该项技能的光学成像空间分辩才能并未真实打破“阿贝极限”,但其所得的物像分辩率比传统的光学成像进步了30%~40%,大大优化了成像质量。
  共聚集激光扫描显微镜现已成为使用广泛的高分辩率三维光学成像东西,经过移动透镜体系对半通明物体进行三维扫描,在计算机体系的辅佐下,对样品从外观到内涵、从静态到动态、从形状到功能进行全方位的调查。
  真实打破
  对“阿贝极限”的真实应战要从20世纪90年代说起。
  1994年,德国的斯蒂芬·黑尔 (Stefan Hell) 提出了受激起射损耗 (STimulated Emission Depletion,简称STED) 技能,用以打破“阿贝极限”完成超高分辩率成像。所谓“阿贝极限”,是光学元件的衍射效应造成的。
  光学显微镜的照明光经光学体系聚集后在样品上形成的光斑实践上是个光的衍射斑,在此斑范围内的样品会宣布照明光引发的荧光,使这部分样品的细节信息无法被分辩。要完成超越“阿贝极限”,关键是设法减少单个扫描点处的有用荧光发光面积。
  黑尔提出的办法非常巧妙,他想象一起使用两束激光来照射样品,一束为激起光,别的一束为空心形的受激起射损耗光,样品上发生受激起射损耗效应的部分不能宣布荧光,仅样品的中心区域可宣布辐射荧光,这样就可到达大大下降荧光激起半径的目的。
  可以想象,完成这项技能的难度相当大,黑尔于2000年总算用两台钛宝石飞秒脉冲激光器完成了超高分辩率受激起射损耗显微成像。
  斯蒂芬·黑尔(Stefan Hell)
  除了受激起射损耗显微技能,还有几项重要的技能获得了打破。
  美国的埃里克·白兹格 (Eric Betzig) 与威廉·莫尔纳 (William Moerner) 分别独立发现了单分子开关的办法,使用图画多次叠加的技能得到单分子的精确定位,再将这些分子的荧光图画合成,可获得比传统光学显微镜至少高10倍以上的分辩率。
  白兹格将该项技能称为光激活定位显微术 (Photo Activated Localization Microscopy,简称PALM)。
  埃里克·白兹格(Eric Betzig)
  威廉·莫尔纳(William Moerner)
  美国哈佛大学的华裔女科学家庄小威 (Xiaowei Zhuang) 等人创造了使用有机染料 (不必荧光蛋白) 对荧光分子的可调控性对单分子进行精确定位,再用图片重组办法获得超高分辩率显微镜图画的技能——随机光学重建显微术 (STochastic Optical Reconstruction Microscopy,简称STORM) 。
  庄小威积极推动了这项技能的打开,既完成了三维一起超分辩率闪现,又进一步进步了该技能的成像速率 (庄小威的成果与埃里克·白兹格的成果在2006年一起宣布,仅仅庄小威投稿的日期晚了4个月)。
  庄小威(Xiaowei Zhuang)
  正是由于上述多项技能的立异,光学显微镜最终完成了“阿贝极限”的真实打破 (分辩率达20纳米),使能进行活体物质调查的光学显微镜又重新焕宣布青春,这对多个前沿研讨范畴发生了严重影响,尤其是为常温下活体生物学研讨带来了严重机会。
  生物学家们可以实时调查到生物分子怎么在大脑神经细胞之间生成神经突触,看到病毒颗粒侵入细胞的全进程,乃至还可追寻帕金森、阿尔兹海默症、亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积进程 (莫尔纳、黑尔、白兹格三人被授予2014年诺贝尔化学奖(很遗憾庄小威未能获奖))。
  打破“阿贝极限”的光学显微镜
  受激起射损耗显微镜(STED)(左)与一般光学显微镜图画(右)的比照
  共聚集显微镜(CLSM)(左)与受激起射损耗显微镜(STED)图画(右)的比照
  难能可贵的是,黑尔在获诺贝尔奖之后给自己制定了进一步进步分辩率的奋斗方针——被他称为“后诺奖超分辩率”。
  2017年初,他的团队在Science宣布了题为“Science-2017-Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes”的论文,介绍了结合了STED、PLAM和STORM技能优势的MINFLUX超分辩率荧光显微镜 (也称为纳米显微镜) 。研讨团队的试验完成了6纳米的分辩率,他们的方针是完成1纳米的分辩率,使生物学家不只可看清病毒的结构,还可明晰地调查病毒感染细胞的整个进程,最终找到灭杀病毒的有用办法。
  斯蒂芬·黑尔(Stefan Hell)和他的MINFLUX研讨团队
  共聚集显微镜图画(上左)、受激起射损耗显微镜(STED)图画(上右)、超分辩率荧光显微镜(MINFLUX)图画(下)的比照
  据最新报导,黑尔的MINFLUX团队又获得了新进展,完成了细胞中3D多色、优于1纳米分辩率的成像,题为“MINFLUX nanoscopy delivers 3D multicolor nanometer resolution in cells”的论文2020年1月13日宣布在Nature Methods。
  黑尔MINFLUX研讨团队获得的最新进展
  双色3D MINFLUX纳米显微镜图画显示的细胞散布及蛋白质间隔(上图),传统显微镜图画(下图左)
  生命体与成像设备分辩率的对应联系示意图
  结 语
  “阿贝极限”是恩斯特·阿贝 (Ernst Abbe) 1873年提出的。依据阿贝的理论,光的根本衍射性质决定了以可见光 (波长范围在0.38~0.78微米) 作为光源的光学显微镜无法完成0.2微米(约可见光波长的二分之一) 以下的分辩率。
  在一代又一代科学家持之以恒的尽力之下,百余年之后的21世纪初,光学显微镜总算完成了“阿贝极限”的真实打破!超高分辩率的光学显微镜使科学家们能深化了解病毒在活细胞内感染、复制及开释的整个动态进程,为人类攻克致病病毒供给了有力的东西。
  “阿贝极限”的真实打破阅历了百余年,衷心肠向为此做出杰出奉献的科学家们表明深深的敬意!

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